• فالکون cc10

• سرنگ (Suppa، ایران)

• Rotator (Hidolgh، آلمان)

• ورتکس (ندای فن، ایران)

• pH متر (Horiba، ژاپن)

• Hot plate (کره)

• تانک الکتروفورز (اختریان، ایران)

• Thermocycler (T-CY or EPS 600 creacon، هلند)

• منبع تغذیه جریان الکتریکی (اختریان، ایران)

• Gel Documentation System (Cambridge، انگلیس)

• میکروسانترفوژ (Hehrin، آلمان)

• ترازوی دیجیتالی (Horiba، ژاپن)

• فالکون cc 50 (Nunc، بلژیک)

۲-۲- روش جمع آوری نمونه:
جمعیت مورد مطالعه شامل ۳۰۰ زن (۱۵۰ زن مبتلا به سندروم تخمدان پلی کیستیک و ۱۵۰ زن سالم به عنوان گروه شاهد) می باشد که از لحاظ سن (۵ ± سال) همسان سازی شدند. نمونه های خون گروه بیمار و گروه شاهد از مرکز ناباروری و جراحی های محدود زنان شیراز- دکتر رستمی جمع آوری گردید. به منظور تعیین ژنوتیپ افراد مورد مطالعه ۵ سی سی خون از آنها گرفته شد و درون تیوب های حاوی EDTA قرار داده شد. نمونه های جمع آوری شده به همراه پرسش نامه ای که توسط افراد تکمیل شده بود، به آزمایشگاه منتقل و نمونه ها در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
۲-۳- طرز تهیه محلول های مورد نیاز جهت استخراج DNA:
۲-۳-۱- طرز تهیه Lysis buffer :
۲۹/۸ گرم از آمونیوم کلرید (NH₄Cl)، ۸۴/۰ گرم از (NaHCO₃) و ۰۳۸/۰ گرم از اتیلن دی آمین تترا استات را با آب مقطر استریل حل نموده و به حجم Liter1 رسانیده و pH به ۷ رسانده شد.
شرایط نگهداری : در یخچال نگهداری شود.
۲-۳-۲- طرز تهیه SE buffer :
۰۹/۱ گرم از NaCl (سدیم کلرید) و ۳۲/۲ گرم از EDTA را با ۲۴۰ سی سی dH₂O توسط Magnet حل نموده و pH را به کمک NaOH به ۳/۸-۸ رسانده و سپس حجم نهایی را به ۲۵۰ سی سی می رسانیم.
شرایط نگهداری : در یخچال نگهداری شود.
۲-۳-۳- طرز تهیه SDS (سدیم دو دسیل سولفات) ۱۰ درصد :
۵ گرم سدیم دو دسیل سولفات را با ۴۰ سی سی آب مقطر (dH₂O) استریل حل نموده و در بن ماری حرارت می دهیم (تا حدود ۶۸ درجه، جهت حل کردن کریستال ها). سپس ارلن را با گرفتن زیر شیر آب، سرد می کنیم. ۹ سی سی آب استریل به مواد اضافه کرده و از ۵/۲ میکرولیتر HCl جهت رساندن pH = 7.2 استفاده می شود. حجم را به ۵۰ سی سی می رسانیم.
۲-۳-۴- طرز تهیه نمک اشباع:
۲۰ میلی لیتر آب مقطر را در یک فالکون ۳۰ میلی لیتری ریخته و سپس مقداری نمک را به فالکون اضافه کرده و مخلوط می کنیم. این کار را آنقدر تکرار می کنیم که دیگر نمک در آب حل نشود و آب از نمک اشباع شود.
۲-۴- روش Salting out استخراج DNA :

• دو سی سی نمونه خون را در لوله آزمایش ریخته و سه برابر آن Lysis buffer اضافه می کنیم. درب لوله ها را با پارافیلم بسته و چند بار به آرامی سر و ته می کنیم تا خوب مخلوط شوند.

• • • نمونه ها را برای ۲۰ دقیقه در یخچال قرار می دهیم. در این مدت هر ۵ دقیقه آنها را سر و ته می کنیم.

  ( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

• نمونه ها را پس از خروج از یخچال به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۸۰۰-۲۰۰۰ سانتریفوژ می کنیم.

• مایع رویی را به آرامی خالی کرده تاحدود ۱-۵/۱ سانتی متر از نمونه ته لوله باقی بماند و مجدداً ۳ برابر حجم محلول باقی مانده Lysis buffer اضافه می کنیم و درب لوله ها را با پارافیلم می- بندیم و بهم می زنیم و مراحل قبل را تا جایی تکرار می کنیم تا رسوب سفید مایل به صورتی حاصل شود.

• مایع را به طور کامل خارج کرده و آب اضافی را با دستمال می گیریم. هم حجم خون اولیه (۲ سی سی) SE buffer اضافه می کنیم و کمی بهم می زنیم. ۲۰۰ میکرولیتر SDS و ۱۴ میکرولیتر پروتئیناز K نیز به حالت مایل اضافه می کنیم. درب لوله را با پارافیلم می بندیم و خوب به هم می زنیم تا رسوب از ته لوله جدا شود و لوله ها را ورتکس می کنیم.

• نمونه ها به مدت ۱۶ ساعت (over night) در بن ماری ۵۶ در جه سانتی گراد قرار داده می شوند.

• به نمونه ها پس از خروج از بن ماری ۹۰۰ میکرولیتر نمک اشباع اضافه کرده و کمی بهم می زنیم و ۱۷۰۰ میکرولیتر کلروفرم اضافه می کنیم و سپس به مدت ۵/۱ ساعت با دور ۳۵۰۰ سانتریفوژ می کنیم.

• در این مرحله در لوله ها سه فاز تشکیل می شود: فاز اول شامل نمک است، فاز روی آن غشاهای سلولی و سایر ترکیبات ناشی از تخریب سلول ها به صورت یک لایه سفید رنگ دیده می شود، مایع رویی حاوی DNA می باشد.

• مایع شفاف رویی را با دقت جدا کرده و در لوله دیگری که اتوکلاو شده است می ریزیم. حدود ۳-۲ برابر مایع اتانول ۹۶ درصد (مطلق) اضافه می کنیم. لوله ها را به آرامی تکان داده تا کلاف DNA ظاهر گردد.

۱۰- کلاف DNA را با سمپلر ۱۰۰۰ برداشته و در تیوب ۵/۱ میلی لیتر می ریزیم. ۲۰ ثانیه با دور ۱۲۰۰۰ نمونه ها را سانتریفوژ کرده و سپس کل الکل را خارج می کنیم.
۱۱- دو الی سه بار اتانول ۷۰ درصد به مقدار ۱۰۰ میکرولیتر به نمونه ها اضافه می کنیم و هر بار سانتریفوژ کرده و الکل را خارج می کنیم.
۱۲- نمونه ها را به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه زیر هود یا فضای آزاد قرار می دهیم تا کاملاً خشک شوند. حدود ۱۰۰-۱۵۰ میکرولیتر آب استریل یا بافر TE به هر نمونه اضافه کرده تا در آن حل گردد.
۲-۵- اصول روش Salting out :
اسید آمینه های هیدروفوبیک و هیدروفیلیک در مولکول های پروتئین وجود دارد. پس از تا خوردن پروتئین در محلول آبی، اسید های آمینه هیدروفوبیک معمولاً مناطق آبگریز محافظت شده را شکل داده در حالی که اسید های آمینه هیدروفیلیک با مولکول های حلال پوششی ارتباط داشته و اجازه می دهد پروتئین ها با مولکول های آب اطراف پیوند های هیدروژنی تشکیل دهند. اگر به اندازه کافی پروتئین های سطحی هیدروفیلیک باشد، پروتئین می تواند در آب حل شود. هنگامی که غلظت نمک افزایش می یابد، برخی از مولکول های آب توسط یون های نمک جذب شده، که موجب کاهش تعداد مولکول های آب در دسترس برای تعامل با بخش باردار پروتئین می شود. به عنوان یک نتیجه از افزایش تقاضا برای مولکول های حلال، اثر متقابل پروتئین-پروتئین نسبت به اثر متقابل حلال-جسم حل شده قوی تر هستند؛ مولکول های پروتئین توسط تشکیل اثرات متقابل هیدروفوبیک با یکدیگر لخته می شوند. این فرایند به عنوان Salting out شناخته شده است.
۲-۶-Gel Documentation (سیستم تصویر برداری از ژل) :
سیستم تصویر ساز ژل، به طور گسترده ای در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی برای تصویر برداری و مستند سازی ژل های آگارز یا پلی آکریل آمید نوکلئیک اسید و پروتئین که به طور معمول با اتیدیوم بروماید یا فلورسانس های دیگر مانند سایبرگرین استفاده می شود. به طور کلی، یک سیستم تصویر ساز ژل از یک ultraviolet light transilluminator، یک هود برای محافظت منابع نور خارجی و یک دوربین برای عکس گرفتن تشکیل شده است(شکل۲-۱). در این تحقیق، پس از استخراج DNA از لنفوسیت های خون محیطی به کمک روش salting out، به منظور تأئید DNA استخراج شده، مقدار کمی (حدود ا میکرولیتر) از DNA روی ژل آگارز دو درصد الکتروفورز شد و پس از مشاهده توسط دستگاه Gel Documentation، وجود DNA تأئید گردید.
شکل۲-۱- سیستم تصویر برداری از ژل
۲-۷- الکتروفورز
الکتروفورز حرکت ذرات پراکنده شده نسبت به یک مایع تحت تاثیر میدان الکتریکی فضایی یکنواخت است. این پدیده الکتروکینتیک برای اولین بار در سال ۱۸۰۷ توسط فردیناند فردریک ریوس مشاهده شد، کسی که متوجه شده است که استفاده از یک میدان الکتریکی ثابت باعث پراکنده شدن ذرات رس برای مهاجرت در آب شده است. اما در نهایت توسط حضور یک رابط شارژ شده بین سطح ذرات و مایع اطراف آن ایجاد می شود. الکتروفورز ذرات با بار مثبت شارژ شده کاتافورز، در حالی که الکتروفورز ذرات با بار منفی شارژ شده آنافورز نامیده می شود.