Final hold
۱
۸
۱۰
۳-۲-۳-۳-۵- آماده سازی مخلوط واکنش PCR
کلیه مراحل آماده سازی روی یخ انجام گرفت. هر یک از اجزای واکنش طبق مقدار محاسبهشده به مخلوط در ویالml 2/0 اضافه گردید. بهتر است آب فاقد یون اولین جزء واکنش باشد تا سایر اجزا در آن حل شوند و DNAالگو و آنزیم اجزای آخری هستند که اضافه میشوند. بعد از اسپین نهایی ویالها در دستگاه ترموسایکلر با برنامه حرارتی تنظیم شده،قرار دادهشد.
۳-۲-۳-۳-۶- ژل الکتروفورز محصولات PCR
بعد از انجام واکنش PCR (زمان حدود min 105)،محصول واکنش بایستی روی ژل آگارز۲% (طول محصول PCR با توجه به اطلاعات آغازگرها کم است و قطعات کوچک هستند.این اندازه برای ژنهای PAR, PLP , SRYبه ترتیب ۸۹ ، ۹۰ و ۷۹ بود. پس ژل،غلیظتر از ژلی که برای محصول استخراج DNA استفادهشد،ساختهشد.) بردهشود. این کار برای سنجش صحت : انجام واکنش ،شرایط حرارتی،اجزا و مقادیر استفادهشده آنها در واکنش میباشد .
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۳-۲-۴- واکنش PCR کمّی(Real-Time PCR) :
۳-۲-۴-۱- هدف از انجام این مرحله
برای سنجش کمی قطعات مورد نظر به منظور بررسی مقادیر اسپرمهای واجد کروموزوم X و اسپرمهای واجد کروموزوم Y در هر یک از گاوها و محاسبه نسبت جنسی تحت تأثیر تنش گرمایی[۱۵۴] در گاوهای مختلف (تفاوت فردی)،میبایست از روش Real-Time PCR استفادهکرد. در واقع میزان الگوی اولیه با این روش به راحتی سنجیده می شود .
۳-۲-۴-۲- مواد و لوازم
اتانول ۷۰%
سمپلر و سرسمپلرlµ۱۰۰۰-۱۰۰, µl 100-10 ، lµ۱۰-۱ استریل
DNA الگو (DNA اسپرم گاو)
آب بدون یون استریل
مخلوط اصلی[۱۵۵] واکنش
( Real-Time PCR Master mix kit(2X), RealMODTMGreen,iNtRON Biotechnology,cat#:25344)
رنگ خنثی کننده ROX(ROX Refrrence Dye , (50X) ,(40µl) ,TaKaRa ,cat#:A5201J)
آغازگرهای اختصاصی-۱lµPmol.10 (رفت و برگشت)
ویالهای مخصوص دستگاه
(MicroAmpTMFast 8-Tube Strip , MicroAmpTMOptical 8-CapStip)
جعبه سرد مخصوص قرار دادن ویالها[۱۵۶]
۱۰-دستگاه Applied Biosystems StepOneTM
۱۱-هود لامینار در شرایط نور غیر مستقیم
۳-۲-۴-۳- روش کار
۳-۲-۴-۳-۱- رقیقسازی آغازگرها
به جهت اینکه واکنش Real-Time PCR نسبت به PCR معمولی بسیار حساستر به مقادیر اندک و دقیقتر میباشد،برای جلوگیری از ایجاد توالیهای پرایمر_دایمر،آغازگرها ازغلظت-۱ Pmol.µl۱۰ به غلظتPmol.µl-1۵ رقیق شدند و مقدار آنها در مخلوط واکنش از ۱ به ۵/۰ کاهش یافت.
۳-۲-۴-۳-۲- محاسبه مقادیر مواد واکنشPCR Real-Time در حجم lµ۱۵
جدول(۳-۷):مقادیر مواد واکنش PCR
اجزای واکنش
مقدار مصرف در حجم µl۲۰ (µl)
مخلوط اصلی واکنش
۵/۷
آب استریل فاقد یون
۲/۵
آغازگر رفت (Pmol.µl-1 ۵ )
۵/۰
آخرین نظرات