Final hold

 

۱

 

۸

 

۱۰

 

۳-۲-۳-۳-۵- آماده ­سازی مخلوط واکنش PCR
کلیه مراحل آماده ­سازی روی یخ انجام گرفت. هر یک از اجزای واکنش طبق مقدار محاسبه­شده به مخلوط در ویالml 2/0 اضافه گردید. بهتر است آب فاقد یون اولین جزء واکنش باشد تا سایر اجزا در آن حل شوند و DNA­­­الگو و آنزیم اجزای آخری هستند که اضافه می­شوند. بعد از اسپین نهایی ویال­ها در دستگاه ترموسایکلر با برنامه حرارتی تنظیم شده،قرار داده­شد.
۳-۲-۳-۳-۶- ژل الکتروفورز محصولات PCR
بعد از انجام واکنش PCR (زمان حدود min 105)،محصول واکنش بایستی روی ژل آگارز۲% (طول محصول PCR با توجه به اطلاعات آغازگرها کم است و قطعات کوچک هستند.این اندازه برای ژن­های PAR, PLP , SRYبه ترتیب ۸۹ ، ۹۰ و ۷۹ بود. پس ژل،غلیظ­تر از ژلی که برای محصول استخراج DNA استفاده­شد،ساخته­شد.) برده­شود. این کار برای سنجش صحت : انجام واکنش ،شرایط حرارتی،اجزا و مقادیر استفاده­شده آنها در واکنش می­باشد .

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۲-۴- واکنش PCR کمّی(Real-Time PCR) :
۳-۲-۴-۱- هدف از انجام این مرحله
برای سنجش کمی قطعات مورد نظر به منظور بررسی مقادیر اسپرم­های واجد کروموزوم X و اسپرم­های واجد کروموزوم Y در هر یک از گاو­ها و محاسبه نسبت جنسی تحت تأثیر تنش گرمایی[۱۵۴] در گاو­های مختلف (تفاوت فردی)،می­بایست از روش Real-Time PCR استفاده­کرد. در واقع میزان الگوی اولیه با این روش به راحتی سنجیده­ می­ شود .
۳-۲-۴-۲- مواد و لوازم
اتانول ۷۰%
سمپلر و سرسمپلرlµ۱۰۰۰-۱۰۰, µl 100-10 ، lµ۱۰-۱ استریل
DNA الگو (DNA اسپرم گاو)
آب بدون یون استریل
مخلوط اصلی[۱۵۵] واکنش
( Real-Time PCR Master mix kit(2X), RealMODTMGreen,iNtRON Biotechnology,cat#:25344)
رنگ خنثی کننده ROX(ROX Refrrence Dye , (50X) ,(40µl) ,TaKaRa ,cat#:A5201J)
آغازگرهای اختصاصی-۱lµPmol.10 (رفت و برگشت)
ویال­های مخصوص دستگاه
(MicroAmpTMFast 8-Tube Strip , MicroAmpTMOptical 8-CapStip)
جعبه سرد مخصوص قرار دادن ویال­ها[۱۵۶]
۱۰-دستگاه Applied Biosystems StepOneTM
۱۱-هود لامینار در شرایط نور غیر مستقیم
۳-۲-۴-۳- روش کار
۳-۲-۴-۳-۱- رقیق­سازی آغازگرها
به جهت اینکه واکنش Real-Time PCR نسبت به PCR معمولی بسیار حساس­تر به مقادیر اندک و دقیق­تر می­باشد،برای جلوگیری از ایجاد توالی­های پرایمر_دایمر،آغازگرها ازغلظت-۱ Pmol.µl­۱۰ به غلظتPmol.µl-1­۵ رقیق شدند و مقدار آن­ها در مخلوط واکنش از ۱ به ۵/۰ کاهش یافت.
۳-۲-۴-۳-۲- محاسبه مقادیر مواد واکنشPCR Real-Time در حجم lµ۱۵
جدول(۳-۷):مقادیر مواد واکنش PCR

 

اجزای واکنش

 

مقدار مصرف در حجم µl­۲۰ (µl)

 
 

مخلوط اصلی واکنش

 

۵/۷

 
 

آب استریل فاقد یون

 

۲/۵

 
 

آغازگر رفت (Pmol.µl-1 ۵ )

 

۵/۰

 
موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...