دیپتاسیم فسفات

۲

پلیسوربات ۸۰

۱

تریآمونیوم سولفات

۲

استات سدیم

۵

سولفات منیزیم

۲/۰

سولفات منگنز

۰۵/۰

- برای تهیهی یک لیتر از محیط کشت مایع، ۲/۵۲ گرم از محیط کشت به یک لیتر آب اضافه شد.

- به منظور تهیهی محیط کشت MRS جامد با ۵/۱ درصد آگار، ۱۵ گرم آگار - آگار به یک لیتر محیط کشت مایع اضافه شد.
-pH نهایی محیط کشت MRS مایع معادل ۲/۰±۶ است.
- محیط مانیتول آگار پایه
به منظور تهیه محیط کشت اختصاصی برای شمارش سلولهای لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، اجزای تشکیل دهنده محیط کشت MRS (جدول ۲-۱) در یک لیتر از محیط کشت مایع، با یکدیگر مخلوط شده و به جای ۲۰ گرم در لیتر قند دکستروز، ۲۰ گرم در لیتر قند مانیتول در تهیه محیط کشت به کار رفت (سوکسی و همکاران). سپس با بهره گرفتن از اسید استیک گلایسیال (مرک آلمان) pH محیط کشت در ۲/۰±۶ تنظیم شد.
ب- مواد مورد استفاده جهت ریزپوشانی و پوششدهی باکتری پروبیوتیک و فرایند رهاسازی
- برای ریزپوشانی از صمغ فارسی^[۵۳]، روغن کانولا (لادن، شرکت بهشهر، ایران) و امولسیفایرها شامل DATEM و PGPR90 استفاده شد.
- در آزمونهای رهایش از بافر فسفات استفاده شد و برای تهیهی آن از سدیم دیهیدروژن فسفات دو آبه و دیسدیم هیدروژن فسفات (مرک، آلمان) استفاده گردید.
ج- مواد مورد استفاده در تولید ماست پروبیوتیک
به منظور تهیهی ماست و برای حفظ یکنواختی نمونه های ماست طی انجام آزمایشها، از شیر خشک بدون چربی^[۵۴] ساخت شرکت زرین سپاهان استفاده شد.
د- مواد مورد استفاده در ارزیابی مقاومت باکتری پروبیوتیک در برابر محیط شبیهسازی شده گوارشی
در آزمایشات مربوط به ارزیابی مقاومت باکتری نسبت به محیط شبیهسازی شده گوارشی از هیدروکسید سدیم (NaOH) و اسید هیدروکلریدریک (HCl) تولید شده توسط شرکت مرک آلمان، بایل بووین^[۵۵] تولید شده توسط شرکت سیگما آلدریچ^[۵۶] آلمان استفاده شد.
۳-۱-۳- میکروارگانیسم مورد استفاده
میکروارگانیسمهای مورد استفاده شامل باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 تهیه شده از آزمایشگاه میکروبیولوژی گروه علوم وصنایع غذایی دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی و کشت‌های آغازگر در تولید ماست شامل لاکتوباسیلوسدلبروکی زیرگونه بولگاریکوس^[۵۷] و استرپتوکوکوس ترموفیلوس^[۵۸] تهیه شده از کریستین هانس دانمارک بودند.
۳-۲- عملیات و آزمونهای میکروبی
۳-۲-۱- فعال سازی و نگهداری باکتری پروبیوتیک
کشت خالص فریز شدهی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، در محیط کشت حاوی ۱۵ درصد گلیسرول که در فریزر ^oC80- نگهداری میشد، از نمونه های استوک^[۵۹] موجود در کلکسیون میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی ـ بیوتکنولوژی گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه صنعتی اصفهان تهیه شد. برای فعال سازی باکتری، میکروتیوب محتوی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، بعد از خارج کردن از فریز، در شرایط کاملا استریل و در کنار شعله، در دمای محیط قرارداده شد تا ذوب شود، سپس میکروتیوب به لولهای حاوی ۱۰ میلیلیتر از محیط کشتMRS استریل انتقال داده شد و در انکوباتور میکروآئروفیل (با ۵ درصد دی اکسیدکربن، دمای ۳۷ درجه و به مدت ۱۸ ساعت) گرمخانهگذاری شد. از این کشت روی سطح لام، گسترهی^[۶۰] میکروبی تهیه شد و به منظور بررسی خصوصیات مورفولوژی باکتری، بوسیلهی میکروسکوپ نوری بررسی شد. پس از بررسیهای اولیه، سلولهای باکتری سه مرتبه و به صورت مداوم روی محیط MRS مایع و جامد کشت داده شدند. کشت ثانویه روی محیط کشت MRS جامد انجام شد و پلیتها در شرایط بیهوازی گرمخانهگذاری شدند. به منظور نگهداری کوتاه مدت، کلونیهای خالص تهیه شده بر روی محیط کشت MRS مورب^[۶۱] کشت داده شد و بعد از گرمخانهگذاری به یخچال با دمای ۴ درجه انتقال شد و ماهانه کشت مجدد انجام شد. به منظور نگهداری طولانی مدت، ۵۰۰ میکرولیتر از کشت مایع فعال به میکروتیوب حاوی ۵۰۰ میکرولیتر گلیسرول ۱۵درصد حجمی/ حجمی استریل خالص اضافه شد و بلافاصله در ازت مایع منجمد شد. این نمونه ها در فریزر ۸۰- نگهداری شدند. برای تهیهی کشت فعال در هر مرحله، کلونیهای خالص نگهداری شده در یخچال را در محیط MRS مایع تلقیح کرده و باکتریها به مدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه گرمخانه‌گذاری شدند.
۳-۲-۲- آزمونهای بیوشیمیایی به منظور شناسایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7
۱- رنگ آمیزی گرم
به منظور رنگآمیزی گرم از کلونی تازه، گسترهی میکروبی تازه تهیه شد. پس از خشکشدن نمونه در مجاورت هوا، تثبیت حرارتی صورت گرفته و سپس رنگ کریستال بنفش^[۶۲] به گستره اضافه شد. بعد از یک دقیقه به صورت ملایم با آب شسته شد تا رنگ اضافی پاک شود. در مرحلهی بعد از محلول لوگول استفاده شد. مشابه با مرحلهی قبل، بعد از یک دقیقه گسترهی میکروبی با جریان ملایم آب شست و شو داده شد و به منظور رنگ بری نیز، در مرحله بعد، الکل مطلق به گستره اضافه شد و بعد از ۳۰ ثانیه سطح لام شسته شد. در نهایت سافرانین به مدت یک دقیقه به گستره اضافه شد و بعد از شستن لام و خشک کردن آن در مجاورت هوا شکل، آرایش سلولی و تعیین گرم با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری مشخص شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
۲- آزمون کاتالاز
برای انجام این آزمایش ابتدا یک قطره آب اکسیژنهی ۳ درصد (V/V) روی لام شیشهای قرار داده شد و توسط یک آنس استریل بخشی از یک کلونی تازه به آن اضافه شد و کاملا مخلوط شد. تشکیل یا عدم تشکیل حباب دو مرتبه بررسی شد؛ یکبار بلافاصله بعد از اضافه کردن کلونی و یکبار ۵ دقیقه بعد از اضافه کردن کلونی بررسی شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
۳- آزمون اسپورزا بودن
برای تعیین اسپورزا بودن باکتری از روش شفر- فولتون^[۶۳] استفاده شد. به این صورت که ابتدا گسترهی میکروبی تهیه شد و پس از تثبیت حرارتی رنگ آمیزی با مالاشیت سبز به مدت ۵ دقیقه انجام شد و بعد از شست و شو با جریان ملایم آب سفرانین به مدت یک دقیقه اضافه شد. سپس سطح اسلاید شسته و خشک گردید و در نهایت گسترهی میکروبی با میکروسکوپ نوری، به منظور حضور یا عدم حضور اسپور بررسی شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
۳-۳- آنالیز شیمیایی شیر خشک بدون چربی و صمغ فارسی
کلیه آزمونهای شیمیایی در سه تکرار انجام شدند.
۳-۳-۱- اندازه‌گیری خاکستر