الف
ب
نگاره ۳-۲: الف- نمونه­برداری از ماهیچه (بیوپسی)، ب- بخیه ساده پس از نمونه‎برداری.
۳-۱-۳- نمونه گیری از ماهیچه دوسر ران (پس از کشتار)
پس از کشتار، بره­ها در مدتی کمتر از ۵ دقیقه به­سرعت پوست­کنی شدند، یک نمونه ۳۰-۲۰ گرمی از ماهیچه دوسر ران (پای راست) جدا پس از زدودن خون سطحی (با بهره گرفتن از کاغذ)، چربی­های سطحی از ماهیچه جدا شد. آنگاه نمونه‎ در نیتروژن مایع یخ زده، و در دمای ۸۰- درجه سانتی ­گراد نگهداری شد.
۳-۲- اندازه ­گیری­های آزمایشگاهی
جداسازی، تعیین غلظت میتوکندری و اندازه ­گیری فعالیت مجموعه­های آنزیمی زنجیره­ تنفسی میتوکندری در پژوهشکده­ زیست فن­آوری دانشگاه شیراز انجام ­شد. بیشتر مواد شیمیایی از شرکت (Co., St. Louis, MO, Inc) Sigma-Aldrich و تعداد اندکی مواد شیمیایی (اتانول و فسفریک اسید) از شرکت Merck (Co, Whitehouse, NJ.) خریداری شدند.
۳-۲-۱- جداسازی میتوکندری
در بسیاری از موارد برای بررسی کنش و ساختار یک اندامک، لازم است آن را از سیتوزول و اندامک­های دیگر جدا کرد. یکی از روش­های جداسازی اندامک­ها، جداسازی بر پایه تفاوت در اندازه و نرخ ته­نشینی اندامک­ها است که با روش سانتریفیوژ کردن افتراقی^[۴۱] انجام می­ شود (Lehninger, 2004). جداسازی میتوکندری در دو گامه­ی سانتریفیوژ انجام می­ شود. در گامه اول (سرعت پایین، g 1000-800) اندامک­های بزرگتر مانند هسته و لاشه سلول و در گامه دوم (سرعت بالا، g 15000-10000)، میتوکندری­ها ته­نشین می­شوند. البته ممکن است همراه با میتوکندری­ها، اندامک­های دیگری مانند گرانول­های تراوشی و کیسه­های گلژی (بیشتر در غدد درون‎ریز و برون­ریز) لایزوزوم­ها (در جگر، کلیه، طحال، لوکوسیت­ها و ماکروفاژها) و پراکسی‎زوم‎ها (بیشتر همراه با میتوکندری جدا شده از بافت جگر) نیز ته­نشین شوند که برای خالص­سازی میتوکندری، از سانتریفیوژ شیب غلظت^[۴۲] استفاده می­ شود (Pon and Schon, 2001). در بیشتر پژوهش­ها، برای بررسی میتوکندری­ سلول­های ماهیچه‎ای، تنها از سانتریفیوژ افتراقی، برای جداسازی استفاده شده است (Bottje et al., ۲۰۰۲). پیش­از انباشت میتوکندری، غشا­ی پلاسمایی و پیوندهای بین سلولی با­ روش آنزیمی (Protease K) Kolath, 2006)) و مکانیکی (همگن سازی نرم به کمک هموژنایزر با هاون تفلن) تخریب می‎شوند.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

در این آزمایش، جداسازی میتوکندری­ها از ماهیچه دو سر ران با­ روش کولاس Kolath, 2006)) و با اندکی تغییر انجام شد. به ازای هر نمونه، ۲۰ میلی­لیتر محلول I (100 میلی مولار Sucrose، ۱۰۰ میلی مولار Tris-HCl، ۴۶ میلی مولار KCl و ۱۰ میلی­مولار EDTA با ۴/۷= pH) تهیه شد. نمونه­های پنج گرمی گوشت از یخچال ^oC80- خارج و درون ۱۰ میلی لیتر محلول I سرد شده در یخ، انداخته شد. پس از یخ­گشایی، نمونه­ها با قیچی تکه تکه و برای پنج دقیقه درون ۵ میلی لیتر محلول I دارای ۵ میلی­گرم Protease K در دمای اتاق قرار داده شدند. محلول دارای نمونه برای دو دقیقه با هموژنایزر با هاون تفلن، همگن و برای ۵ دقیقه دیگر درون یخ نگهداری شد. سپس محلول همگن شده، به­درون میکروتیوب ۵/۱ میلی­لیتری ریخته شد و برای ۱۰ دقیقه در دور g1000 و دمای ۴ درجه سانتی ­گراد سانتریفیوژ شد (Sigma centrifuge, model: 1-15pk, UK). پلت تشکیل شده که دارای بقایا و لاشه سلول بود، دور ریخته شد و محلول باقی­مانده برای جداسازی میتوکندری­ها به مدت ۱۵ دقیقه در دور g 10,000 و دمای ۴ درجه سانتی ­گراد سانتریفیوژ شد. دراین فاصله زمانی، محلول شستشو (محلول I دارای ۵/۰ درصد BSA^[43]) آماده شد. در پایان گامه دوم سانتریفیوژ کردن، پلت تشکیل شده که دارای میتوکندری­ها بود نگه داشته شد و مایع رویی، دور­ریخته شد. پلت میتوکندری­ها، با یک میلی‎لیتر محلول شستشو و با پیپت کردن، شستشو شد و برای ته­نشین شدن دوباره میتوکندری­ها، برای ۱۵ دقیقه دیگر در دمای ۴ درجه سانتی گراد و دور g 10,000 سانتریفیوژ شد. در این مدت، به­ازای هر نمونه، ۲ میلی لیتر محلول II، (دارای ۲۳۰ میلی مولار Mannitol، ۷۰ میلی مولار Sucrose، ۲۰ میلی مولار Tris-HCl، ۵ میلی مولار KH₂PO₄ و با ۴/۷=pH) ساخته شد. پس­از آخرین گامه سانتریفیوژ، محلول رویی تخلیه و پلت بدون به­هم خوردن، با یک میلی لیتر از محلول II به آرامی شستشو شد. با پیپت کردن ۱ میلی­لیتر محلول II، میتوکندری­ها درون محلول به­ طور کامل معلق شدند. پس از مخلوط کردن کامل میتوکندری­ها درون محلول، ۵۰ میکرولیتر از محلول برای اندازه‎گیری غلظت میتوکندری به­ صورت جداگانه در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد نگهداری شد و باقی­مانده نمونه­های میتوکندری، به سرعت در نیتروژن مایع منجمد و در دمای ^oC80- (فریزر ژال تجهیز، ایران) نگهداری شدند.
۳-۲-۲- اندازه ­گیری غلظت پروتین میتوکندریایی^[۴۴]
برای تعیین غلظت میتوکندری، غلظت پروتین، اندازه ­گیری می­ شود و به­ صورت غلظت پروتین میتوکندریایی بیان می­ شود. فعالیت آنزیمی، بر پایه مقدار پروتین میتوکندریایی (واحد/میلی گرم پروتین میتوکندریایی) محاسبه می­ شود Pon and Schon, 2001)).
روش Bradford یک روش رنگ سنجی برای اندازه ­گیری غلظت پروتین است که به‏سبب سادگی و حساسیت بالا، کاربرد زیادی دارد. اساس این روش، تغییر بیشینه جذب برای محلول اسیدی Coomassie blue G-250 از ۴۶۵ نانومتربه ۵۹۵ نانومتر هنگام پیوند یافتن با پروتین است. با افزایش غلظت پروتین، جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر به سبب افزایش پیوندهای بین پروتین و رنگ Coomassie blue G-250، افزایش می­یابد. برای تعیین همبستگی بین میزان جذب و غلظت پروتین، از غلظت­های استاندارد پروتین (بیشتر آلبومین سرم گاوی- BSA) استفاده می­ شود (Wenk and Fernandis, 2007).
در این آزمایش، اندازه ­گیری غلظت پروتین میتوکندریایی با روش Bradford و بر پایه رویه توضیح داده شده به­وسیله لارنس و داویس(Lawrence and Davies 1986) انجام شد. برای تهیه محلول Bradford، ۱۰ میلی گرم رنگ Coomassie blue G-250 در ۵ میلی لیتر اتانول ۹۵% به­ طور کامل حل شد. سپس، ۱۰ میلی لیتر فسفریک اسید ۸۵% به آن افزوده شد و پس از رساندن حجم به ۱۰۰ میلی لیتر، در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد. آلبومین سرم گاوی به­عنوان محلول پروتین استاندارد، به­کار برده شد. در آغاز، محلولی دارای یک میلی‎گرم BSA دریک میلی لیتر محلول II تهیه شد و سپس، به غلظت­های ۲۵/۰، ۵/۰، ۷۵/۰، ۱ و ۵/۱ میلی‎گرم در میلی لیتر آماده شدند. از هر غلظت پروتین استاندارد،۱۰ میکرولیتر به ۹۹۰ میکرولیتر محلول Bradford (که پیشاپیش با دمای اتاق، هم­دما شده بود) افزوده شد، با پیپت کردن به‏طور کامل مخلوط شد و ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. در کیووت‎های پلاستیکی^[۴۵] و اسپکتروفتومتر (TECHNE – Specgene، آمریکا)، مقدار جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر (۲ تکرار) اندازه ­گیری شد. مقدار جذب نور در حضور نمونه­های دارای میتوکندری نیز با دوبار تکرار، اندازه ­گیری شد. اگر غلظت میتوکندری­ها بیشتر از بیشینه محلول استاندارد (۵/۱ میلی­گرم/میلی لیتر) بود، با افزودن حجمی برابر با حجم نمونه از محلول II، غلظت به نصف کاهش داده شد. سپس، معادله خط همبستگی میزان جذب نور و غلظت پروتین محاسبه و غلظت نمونه ها تعیین شد (نگاره ۳-۳).
نگاره ۳-۳: همبستگی مقدار جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر با غلظت پروتین.
۳-۲-۳- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه­های آنزیمی زنجیره­ی تنفسی
فعالیت هر یک از مجموعه­های آنزیمی زنجیره تنفسی (Cox I-V) با روش بوهرس­نوتت (Bouhours-Nouetet al., ۲۰۰۵) و سندلاین(Sandelin, 2005) ، با اسپکتروفتومتر UV (TECHNE – Specgene) و در کیووت کوارتز، تغییر در جذب نور به­ سبب تغییر در غلظت سوبسترای ویژه هر یک از آنزیم­ها اندازه ­گیری شد. برای شکستن غشای میتوکندری، محلول دارای میتوکندری سه بار در نیتروژن مایع، یخ­زده شد و سپس یخ گشایی شد. اندازه ­گیری­ها، در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و در حجم پایانی ۵۰۰ میکرولیتر و با دوبار تکرار برای هر نمونه، انجام شد. با بهره گرفتن از ضریب جذب، فعالیت هر یک از آنزیم­ها، کمی شده و به­ صورت واحد در میلی­گرم پروتین میتوکندریایی بیان شد.
۳-۲-۳-۱- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه آنزیمی I (NADH – یوبی­کویی­نون اکسیدو ردوکتاز)
در زنجیره تنفسی، Complex I یک مجموعه آنزیم بزرگ با ۴۲ زنجیره پلی پپتیدی و دارای یک فلاووپروتین و حداقل شش مرکز آهن-سولفور است. الکترون به وسیله­ بازوی ماتریکسی Cox I از NADH گرفته شده و در بازوی درون غشایی به یوبی­کویی­نون^[۴۶] داده می‎شود (نگاره ۳-۴). روتنون^[۴۷] که یک ترکیب گیاهی است و به­ طور رایج به­عنوان حشره­کش مورد استفاده قرار می­گیرد، فعالیت Cox I را مهار می­ کند (Lehninger, 2004). به­سبب این­که برخی آنزیم‏ها مانند NADH: cytochorome b₅ reductase (یک آنزیم اکسید کننده NADH، چسبیده به غشای بیرونی میتوکندری و غیر حساس به روتنون)، فعالیت همانند­ی با Cox I دارند، ارزیابی فعالیت ویژه­ی Cox I، به­ صورت فعالیت حساس به روتنون^[۴۸] اندازه ­گیری می­ شود (Pon, 2001 Schon and).
نگاره ۳-۴: ساختار و کنش مجموعه­آنزیمی I زنجیره تنفسی(Lehninger, 2004).
اندازه ­گیری در چند گامه انجام شد:
الف) تهیه محلول­های KH₂PO₄ (۱۰۰ میلی­گرم در میلی­لیتر آب، ۵/۷=pH)، KCN (یک میلی­گرم در میلی­لیتر آب)، MgCl₂ (۱۰ میلی­گرم در میلی­لیتر آب)، Antimycin A (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول)، یوبی­کویی­نون ۲ (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول)، BSA (دو میلی­گرم در میلی­لیتر آب) NADH (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول) و Rotenone (یک میلی­گرم در میلی­لیتر اتانول).
ب) انکوباسیون ۱۰ تا ۲۰ میکرو­گرم پروتین میتوکندریایی (۱۰ میکرولیتر از محلول میتوکندری جداسازی شده) در ۲۴۰ میکرو­لیتر آب در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد برای ۲ دقیقه درون کیووت کوارتز.
پ) افزودن محلول واکنشی شامل ۱۰ میلی­مولار KH₂PO₄، ۲/۵ میلی­مولار KCN، دو میکرو­گرم در میلی­لیتر Antimycin A، ۱۰۰ میکرومولار یوبی­کویی­نون ۲، یک میلی‎گرم در میلی‎لیتر BSA و ۲/۵ میلی­مولار MgCl₂، قرار دادن در دستگاه اسپکتروفتومتر و صفر کردن مقدار جذب نور در طول موج ۳۴۰ نانومتر.
ت) آغاز واکنش با افزودن ۲۰۰ میکرومولار NADH و مخلوط کردن کامل آن با محلول واکنشی به­وسیله پیپت کردن.
ث) خواندن مقدار جذب نور ۵ دقیقه پیش و پس از افزودن دو میکرو­گرم در میلی‎لیتر روتنون.
ج) محاسبه مقدار کاهش جذب نور ویژه­ی فعالیت Cox I، ضرب کردن آن در ضریب جذب mM^-1cm^-1 ۲۲/۶ برای محاسبه مقدار فعالیت آنزیم و تصحیح آن برای یک میلی‎گرم پروتین میتوکندریایی (معادله ۳-۱).
معادله ۳-۱
Cox I activity (U/mg Protein.)= {[(A-A’)]-[(A’-A'’ × (۶.۲۲×۱۰۰۰)]}/(C×۱۰)
A= NADH مقدار جذب نور در زمان افزودن
A’= مقدار جذب نور پیش از افزودن روتنون
A'’= مقدار جذب نور پنج دقیقه پس از افزودن روتنون
C= غلظت میتوکندری (میلی­گرم پروتین در میلی­لیتر)
۳-۲-۳-۲- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه آنزیمی II (سوکسینات دی­هیدروژناز^[۴۹])
کمپلکس II که به­نام­های سوکسینات دی­هیدروژناز و یا سوکسینات: یوبی­کویی­نون اکسیدوردوکتاز^[۵۰] نیز شناخته می­ شود، کوچکترین مجموعه آنزیمی زنجیره تنفسی (انتقال الکترون از FADH به یوبی­کویی­نون) و هم­چنین تنها آنزیم پیوند شده با غشا در چرخه کربس (تبدیل سوکسینات به فومارت) به­شمار می ­آید. این آنزیم دارای چهار زیر واحد پروتینی و سه هسته آهن- سولفور است (Lehninger, 2004) (نگاره ۳-۵). فعالیت این آنزیم به دو صورت فعالیت سوکسینات دی­هیدروژنازی و یا سوکسینات: ابی کویی نون اکسیدوردوکتازی اندازه‎گیری می‏شود. در روش نخست، تغییر جذب نور در طول موج ۶۰۰ نانومتر درپی احیا شدن ۲و۶ دی کلروفنول ایندوفنول^[۵۱] (DCPIP) با فنازین متوسولفات (PMS) شاخصی برای میزان فعالیت آنزیم است و در روش دوم، تغییرات جذب در همین طول موج درپی احیای ۲و۶ دی کلروفنول ایندوفنول با یوبی­کویی­نون ۲ اندازه گیری می­ شود. هر دو روش، برای اندازه ­گیری میزان فعالیت Complxe II مناسب است. شایان توجه است که، به سبب اثر مهارکنندگی اگزالواستات، بخشی از Complxe IIها نافعال می­شوند و برای اندازه ­گیری فعالیت این آنزیم به‎طور کامل، باید برای مدت کوتاهی با سوکسینات انکوباتور شود (Pon, 2001 Schon and).
نگاره ۳-۵: ساختار Complxe II زنجیره تنفسی میتوکندری (Scheffler, 2008).
در این آزمایش، فعالیت سوکسینات دی­هیدروژنازی Cox II اندازه ­گیری شد. پس از تهیه محلول­های آبی KH₂PO₄ (۱۰۰ میلی­گرم در میلی­لیتر، ۵/۷=pH)، Sodium succinate (100 میلی­گرم در میلی­لیتر)، KCN (یک میلی­گرم در میلی­لیتر)، PMS (یک میلی­گرم در میلی­لیتر) و DCPIP (یک میلی­گرم در میلی­لیتر)، آزمایش به ترتیب زیر انجام شد:
الف) مقدار ۱۰ تا ۲۰ میکروگرم پروتین میتوکندریایی (۱۰ میکرولیتر از محلول میتوکندری جداسازی شده) برای سه دقیقه درون محلول واکنشی شامل ۵۰ میلی مولار KH₂PO₄، ۱۶ میلی مولار Sodium succinate، ۵/۱ میلی مولار KCN و ۱۰۰ میکرومولار PMS در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور نگهداری شد.
ب) دستگاه اسپکتروفتومتر برای طول موج ۶۰۰ نانومتر تنظیم و با محلول واکنشی دارای میتوکندری بلانک شد.
پ) مقدار ۱۰۰ میکرولیتر DCPIP به­محلول افزوده شد و پس از مخلوط کردن کامل آن به­وسیله پیپت کردن، مقدار جذب نور خوانده شده و در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد نگهداری شد.
ت) پس از پنج دقیقه، دوباره جذب نور اندازه گیری و مقدار کاهش نور محاسبه شد.
ث) با بهره گرفتن از ضریب جذب mM^-1cm^-1 ۲۱ (Sandelin, 2005) و تصحیح برای یک میلی­گرم پروتین، مقدار فعالیت Cox II گزارش شد.
۳-۲-۳-۳- اندازه ­گیری فعالیت مجموعه آنزیمی III (یوبی­کویی­نول سایتوکروم c ردوکتاز)
یوبی­کویی­نون احیا شده (یوبی­کویی­نول^[۵۲]، QH₂) به­وسیله Cox I و Cox II، الکترون را به‎کمک Cox III به سایتوکروم c انتقال می­دهد. مجموعه آنزیمی III دارای ۱۱ زیر واحد پروتینی است که سه پروتین انتقال دهنده الکترون شامل سایتوکروم c₁، پروتین با هسته آهن-سولفور و سایتوکروم b را در­ بر دارند. سایتوکروم b از دو گروه هِم b_L و b_H (b₅₆₂ و b₅₆₆) تشکیل شده است. در دو گامه واکنش­های اکسایش و کاهشِ یک ملکول QH₂ (چرخه­ی Q)، دو ملکول سایتوکروم c₁ و در نتیجه دو ملکول سایتوکروم c احیا می­شوند و هم­زمان، چهار پروتون (H⁺) به فضای بین دو غشا فرستاده می­ شود (نگاره ۳-۶). آنتی مایسین A که فعالیت این مجموعه آنزیمی را مهار می‎کند، برای اندازه ­گیری احیا­ی غیر آنزیمی سایتوکروم c^[53] به­کار می رود (Pon, 2001 Schon and).
­
QH₂+Cyt c₁ (oxidized) → QH2+•Q^-+2H+N+Cyt c₁(oxidized)→
Q^- + ۲H⁺_P + Cyt c₁(reduced) QH2+2H+P+Cyt c₁ (reduced)
QH₂+2 cyt c₁(oxidized)+2H⁺_N→Q+2 cyt c₁ (reduced)+ 4 H⁺_P
نگاره ۳-۶: ساختار و کنش Cox III در زنجیره انتقال الکترون و چرخه Q (Lehninger, 2004).
در این آزمایش، ارزیابی فعالیت مجموعه­ آنزیمی III زنجیره­ی تنفسی در دو گامه انجام شد. گامه اول، شامل تهیه یوبی­کویی­نول ۲ از یوبی­کویی­نون ۲ بود و در گامه دوم، فعالیت آنزیم با اندازه ­گیری افزایش مقدار جذب نور در طول موج ۵۵۰ نانومتر در جریان اکسید شدن یوبی‎کویی­نول ۲ تعیین شد.
۳-۲-۳-۳-۱- احیا کردن یوبی­کویی­نون۲